La Biblioteca Nacional abrió las puertas de su segunda sede, ubicada en el antiguo edificio de la Aduana de Santiago, el 19 de agosto de 1823 (Briseño, Ramón. Noticias históricas, estadísticas y orgánicas de la Biblioteca Nacional de Chile en 1875. Santiago: Imprenta Nacional, 1875, p. 8).

Entre 1818 y 1823, la organización de las colecciones de la Biblioteca Nacional estuvo a cargo de su director Manuel de Salas Corvalán (1754-1841) y del primer bibliotecario Camilo Henríquez (1769-1825). Ambos redactaron, además, el primer reglamento interno, implementaron el sistema de préstamos e intentaron dar inicio al depósito legal y canje internacional.

Tras el retiro de Salas en 1823, continuó en la dirección del establecimiento Camilo Henríquez, quien además se mantuvo como primer bibliotecario.

En 1825, Manuel José Gandarillas (1789-1842) asumió los roles de director y primer bibliotecario. No obstante, a los pocos meses, dejó vacante el cargo al ser elegido ministro de Hacienda por el Director Supremo Ramón Freire.

Tras la salida de Gandarillas, Francisco García-Huidobro Aldunate se desempeñó como director entre 1825 y 1852. El cargo de director de la Biblioteca Nacional era vitalicio y García-Huidobro fue el primero en desempeñarlo hasta la fecha de su muerte.

Durante su gestión, García-Huidobro terminó el traslado de la Biblioteca Nacional desde el edificio de la Aduana al nuevo establecimiento construido específicamente para la institución, ubicado entre las calles Catedral y Bandera, cuya reapertura se realizó el 25 de noviembre de 1834.

García-Huidobro se encargó también de redactar y publicar el segundo reglamento de la institución, con el que fijó formalmente "las normas de trabajo interno y de atención del público en la biblioteca"; además, prohibió "la práctica de que fuesen los lectores mismos quienes buscaran los libros de su interés en las colecciones" (Silva Cruz, Raúl. "Reseña Histórica de la Biblioteca Nacional". Revista Mapocho. Sesquicentenario de la Fundación de la Biblioteca Nacional. Santiago: La Biblioteca, 1963, p. 163-164).

En 1846, García-Huidobro se involucró en la redacción de la Ley de Imprenta, más conocida como Ley sobre abusos de la libertad de imprenta, que tenía por propósito que las imprentas del país depositaran dos ejemplares en la Biblioteca Nacional, con lo cual se aseguró de recibir nuevos ingresos a las colecciones. También bajo su mandato, el Gobierno traspasó a la institución la Imprenta del Estado con la finalidad de que fuera administrada por el director de la biblioteca y se autofinanciara. Desde entonces fue conocida, entre otros nombres, como la "Imprenta de la Biblioteca" (Briseño, p. 10).

En 1852, Vicente Arlegui Rodríguez (1790-1864) asumió como director de la Biblioteca Nacional en reemplazo de Francisco García-Huidobro Aldunate. Arlegui llevó a cabo el primer catálogo de la institución, publicado en 1854 bajo el título de Catálogo por orden alfabético de los libros que contiene la Biblioteca Nacional de Santiago de Chile.

Durante la administración de Arlegui, la Biblioteca siguió "incrementando su fondo cada día, mediante las leyes de imprenta y de propiedad literaria, los encargos que se hacían periódicamente a Europa y la adquisición de algunas importantes colecciones de libros dentro del mismo país. (…) De esta época datan también los primeros catálogos impresos de la Biblioteca: uno para su fondo general y otro para la sección de Egaña" (Galdames, Luis. "La Biblioteca Nacional". Revista Mapocho. Sesquicentenario de la Fundación de la Biblioteca Nacional. Santiago: La Biblioteca, 1963, p. 123). Hasta el final de su gestión la Biblioteca poseía "37.780 volúmenes contados uno a uno, y de los cuales 2.000 eran de obras americanas", entre las que se contó la adquisición de la Biblioteca Americana de Benjamín Vicuña Mackenna (1831-1886), que constó de "1.606 volúmenes de obras americanas" (Briseño, p. 11).

Vicente Arlegui Rodríguez falleció en 1864 mientras era director de la biblioteca y lo relevó en el cargo Ramón Briseño Calderón (1814-1898), quien entonces era funcionario de la institución y autor de la Estadística de la Literatura Chilena (1862).

Briseño se abocó en su trabajo como director a ordenar las colecciones, redactar los catálogos manuscritos faltantes, llegando -según el propio Briseño- a más de cien, a los que sumó "suplementos, también impresos ya en número de siete, comprensivos de las obras que han entrado al establecimiento desde 1871 hasta 1874, y de algunas en 1875" (Briseño, p. 13).

Ramón Briseño inició la publicación de las estadísticas de la Biblioteca Nacional en los Anales de la Universidad de Chile desde 1861. En el año 1871, Briseño creó la Oficina de canjes de publicaciones internacionales y logró pactos de intercambio con "Ecuador, Perú, Honduras, Salvador, Nicaragua, República Argentina, su Gobierno, la Biblioteca de la Universidad de Buenos Aires y la Pública de la misma ciudad, Costa Rica, Colombia (Estados Unidos de), Bolivia, Italia, Uruguay, su Gobierno y Biblioteca pública, y Brasil" (Briseño, p. 11-14).

Durante la dirección de Briseño, la Biblioteca Nacional adquirió la biblioteca del religioso Ignacio Víctor Eyzaguirre y la biblioteca personal de Andrés Bello (1781-1865), que estaba dispersa entre el Ministerio del Interior y los Tribunales de Justicia (Galdames, p. 123-124).

Briseño se mantuvo en su cargo durante veintiún años, en los que publicó diversos textos relacionados con la historia y estadísticas de la biblioteca, como los tomos de la Estadística Bibliográfica de la Literatura Chilena: 1812-1876 (1876) y Noticias históricas, estadísticas y orgánicas de la Biblioteca Nacional de Chile (1875).

Ramón Briseño recibió su jubilación en septiembre de 1886 y en su lugar fue nombrado como director Luis Montt Montt (1848-1909), quien comenzó un proceso de modernización de la Biblioteca Nacional.